Digital Polymerase Chain Reaction
Die
(zu deutsch ‚Digitale Polymerase-Kettenreaktion‘, auch dPCR, digital PCR, Digital-PCR) ist eine biochemische Methode zur Mengenbestimmung einzelner DNA-Sequenzen.[1] Sie ist eine Variante der Polymerase-Kettenreaktion.
Prinzip
Die dPCR verwendet im Gegensatz zur PCR eine Vereinzelung der DNA-Moleküle durch Grenzverdünnung und Mikrofluidik in einer großen Anzahl getrennter Reaktionsgefäße mit einem Volumen im Femtoliterbereich (z. B. 36 fL).[2][3] Dadurch werden im Unterschied zur Mengenbestimmung per qPCR Varianzen der Amplifikationseffizienz vermieden, bei geringerer Empfindlichkeit gegenüber PCR-Inhibitoren, aber höherer Nachweisgrenze.[4] Die Verteilung der DNA-Moleküle folgt der Poisson-Verteilung.
Die Amplifikation mit der DNA-Polymerase erfolgt mit den vereinzelten DNA-Molekülen. Daher kommt es in jedem Reaktionsgefäß zu einem digitalen Ergebnis (Amplifikation: ja oder nein), woher die Bezeichnung stammt. Durch Auszählen einer großen Anzahl von Reaktionsgefäßen (High-throughput screening mit circa 20.000 Reaktionsgefäßen auf einem Quadratmillimeter)[2] wird eine statistische Signifikanz erreicht. Der Anteil an Reaktionsgefäßen mit erfolgter Amplifikation ist proportional zur eingesetzten DNA-Menge der amplifizierten DNA-Sequenz, was zur Mengenbestimmung verwendet wird. Die dPCR kann auch mit Varianten der isothermalen DNA-Amplifikation kombiniert werden.[4]
Anwendungen
Die dPCR wird unter anderem zur Diagnostik von Pathogenen,[5] zur Bestimmung selten vorkommender DNA-Sequenzen und Gene copy number variants,[6] selten vorkommender Mutationen[7] (Primer-bindende Varianten unter 1 %)[8] und zu Mengenvergleichen bei der Genexpression verwendet.[9]
Geschichte
Die dPCR wurde 1992 von Alec A. Morley und Pamela J. Sykes entwickelt.[1]
Literatur
- B. K. Jacobs, E. Goetghebeur, L. Clement: Impact of variance components on reliability of absolute quantification using digital PCR. In: BMC Bioinformatics. Band 15, 2014, S. 283, doi:10.1186/1471-2105-15-283, PMID 25147026.
Einzelnachweise
- ↑ a b P. J. Sykes, S. H. Neoh, M. J. Brisco, E. Hughes, J. Condon, A. A. Morley: Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. In: BioTechniques. Band 13, Nummer 3, September 1992, S. 444–449, PMID 1389177.
- ↑ a b Y. Men, Y. Fu, Z. Chen, P. A. Sims, W. J. Greenleaf, Y. Huang: Digital polymerase chain reaction in an array of femtoliter polydimethylsiloxane microreactors. In: Analytical chemistry. Band 84, Nummer 10, Mai 2012, S. 4262–4266, doi:10.1021/ac300761n, PMID 22482776.
- ↑ B. Vogelstein, K. W. Kinzler: Digital PCR. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 96, Nummer 16, August 1999, S. 9236–9241, PMID 10430926, PMC 17763 (freier Volltext).
- ↑ a b G. Nixon, J. A. Garson, P. Grant, E. Nastouli, C. A. Foy, J. F. Huggett: Comparative study of sensitivity, linearity, and resistance to inhibition of digital and nondigital polymerase chain reaction and loop mediated isothermal amplification assays for quantification of human cytomegalovirus. In: Analytical chemistry. Band 86, Nummer 9, Mai 2014, S. 4387–4394, doi:10.1021/ac500208w, PMID 24684191.
- ↑ R. H. Sedlak, K. R. Jerome: Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. In: Diagnostic microbiology and infectious disease. Band 75, Nummer 1, Januar 2013, S. 1–4, doi:10.1016/j.diagmicrobio.2012.10.009, PMID 23182074, PMC 3519953 (freier Volltext).
- ↑ L. B. Pinheiro, V. A. Coleman, C. M. Hindson, J. Herrmann, B. J. Hindson, S. Bhat, K. R. Emslie: Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. In: Analytical chemistry. Band 84, Nummer 2, Januar 2012, S. 1003–1011, doi:10.1021/ac202578x, PMID 22122760, PMC 3260738 (freier Volltext).
- ↑ D. Pekin, Y. Skhiri, J. C. Baret, D. Le Corre, L. Mazutis, C. B. Salem, F. Millot, A. El Harrak, J. B. Hutchison, J. W. Larson, D. R. Link, P. Laurent-Puig, A. D. Griffiths, V. Taly: Quantitative and sensitive detection of rare mutations using droplet-based microfluidics. In: Lab on a Chip. Band 11, Nummer 13, Juli 2011, S. 2156–2166, doi:10.1039/c1lc20128j, PMID 21594292.
- ↑ L. Miotke, B. T. Lau, R. T. Rumma, H. P. Ji: High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR. In: Analytical chemistry. Band 86, Nummer 5, März 2014, S. 2618–2624, doi:10.1021/ac403843j, PMID 24483992, PMC 3982983 (freier Volltext).
- ↑ P. Manoj: Droplet digital PCR technology promises new applications and research areas. In: Mitochondrial DNA. [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] April 2014, doi:10.3109/19401736.2014.913168, PMID 24779593.
