Benutzer:Meta-kaercher/Warum Fluoreszenzmikroskopie bei der Krebsforschung versagt hat.

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== Warum Fluoreszenzmikroskopie in der Krebsforschung versagt hat ==
                                     M.Kaercher

" Malignitätskriterien in der konventionellen Urinzytologie richten sich in wesetlichen nach zytomorphologischen Veränderungen des Zellkerns und nicht nach Form und Färbung des Zytoplasmas." .

Nicht alle Wissenschaftler teilen diese Meinung: "Zytoplasmatische Charaktere werden in der Krebsforschung kaum in Betracht gezogen." .

  Das wollte L. von Bertalanffy mit der Acridinorange Fluoreszenmikroskopischen-Methode ändern. Warum hat L.von Bertalanffy die Acridinorange-Methode ausgewählt? Er begründet es so:"Die Acridinorange-Methode ist dadurch ausgezeichnet,daß sie außer den morphologischen Kriterien malignen Zellen (Große und Form der Zellen und Kerne, Hyperchromatismus, multiple Nucleolen, Pleomorphismus, Vielkernigkeit, Kern-Plasmarelation usf. biochemische Veränderungen im Cytoplasma (RNS-haltige Strukturen aufzeigen), die für malignes Wachstum charakteristisch und Wahrscheinlich von grundsätzlicher Bebeutung sind."  
  W.Kosenow schreibt, daß man frühe Veränderungen im Protoplast durch Farbmetachromasie erkennen kann:" Da dieser Fluoreszenzwechsel bereits vor dem Auftreten struktureller Veränderungen faßbar sein kann, kommt der Acridinorange Methode in der Erkennung beginnender degenerativer Veränderungen eine Bedeutung zu, die im Einzelfall sogar die Möglichkeiten der morphologischen Beurteilung im Phasenkontrast übertreffen kann."  
  Begründer der Acridinorange-Methode S.Strugger  in sienen Untersuchungen über die Aufnahme und Speicherung der Acridinorange durch lebende und tote Pflanzenzellen hat bewiesen, daß in den lebenden Zellen die Kern-Plasmafluoreszen in allen Fällen grün war, in den toten dagegen kupferrot:" Durch die Färbung mit Acridinorange läßt sich also totes vom lebendigen Protoplasma eindeutig durch Fluoreszenzmetachromasie trennen."   
  Viele Wissenschaftler bestätigten S. Struggers Beobachtungen.      
  Es stellt sich die Frage: Warum haben L.von Bertalanffy und N. Schümmelfeder sich von der vitalen Fluorochromierung getrennt und arbeiteten mit fixierten Objekten?
  Erster Grund: die lebende Zellen reagieren sehr empfindlich auf die äußere Faktoren;
  Zweitens: aus kommerziellen Gründen: ..." unter den in Euroopa und Amerika vorherschenden praktischen Bedingungen( Knappheit zytologisch geschulten Personals, Notwendigkeit der Verschickung von Ausstrichen im allgemeinen wohl nur die hier ausführlich bescriebene Methodik, welche fixierte Präparate verwendet, im weiterem Ausmaße anwendbar sein dürfte."  
  Der dritte Grund- L. von Bertalanffy war überzeugt:" In geeigneter Technik angawendet, unterscheidet die Acridinorange-Fluorochromierung erstens die zwei Typen der Nucleinsäuren: die DNS des Zellkerns erscheint in grüner Fluoreszenz, die RNS des Zytoplasmas und Nucleolus fluoresziert in Farben der roten Seite des Spekrtums." 
  Gerade der dritte Punkt- die Technik und   Überzeugung waren Grund warum die Fluoreszenzmikroskopie in der Krebsforschung versagt hat.
  Acridinorange unterscheidet nicht zwischen DNA und RNA, der Farbstoff unterscheidet zwischen dd-Strängen ( grüne farbe) und ss-Strängen (rote Farbe).  
  Eine Voraussetzung zur differenter Darstellung der beiden Nucleinsäuren war Fixation der Zellen und Gewebe in Alkohol oder Carnoyscher-Lösung, "nicht dagegen nach längerer Härtung in Formalin"   
  Hier liegt der Fehler der Methode von L.von Bertalanffy. Heutzutage werden alle molekular-biologische Untersuchungen mit Paraform durchgeführt, nicht mit Alkohol und Carnoyscherr-Lösung. " Durch die Fixirung mit 4% w/v PFA bleibt die Morphologie des Gewebes erhalten und die RNA degradiert nicht in der Zelle" 
  "Das Polymer von Paraformaldehyd wird zur Fixierung von Zellen und Geweben gebraucht." 
   Gerade den Paraformaldehyd hat L.von Bertalanffy abgelehnt, weil dabei keine kontrastreiche Bilder entstanden.
   Wie wirken die Fixativen, die L.von Bertalanffy benutz hat? Die Lufttrocknung wirkt so:" Das Plasma der lufttrockenen Bakterien Ausstruche färben sich einheitlich stark kupferrot so als ob es durch Hitze fixiert wäre." 
"Rozza und Wyckoff (1950) geben an, daß das Cytoplasma des Wurzelmeristems der Zwiebel eine dichte retikulare Struktur mit sehr feinen Maschen kleiner als 0,05 µ aufweist, wenn mit neutralem Formalin fixiert wird. Flüßigkeiten mit eiweiskoagulierenden Wirkung wie Essigsäure, Trichloressigsäure,Phosphorwolframsäure, Alkohol,Sublimat oder Sylfosalicylsäure zerstören das feine Netzwerk"  
Wirken die Fixative gleichermaße auf RNS und DNS?. Auf diese Frage finden wir die Antwort bei I.Stauf: " Die beiden Haupttypen , Ribonucleinsäure (RNS) mit Ribose und Desoxyribonucleinsäure (DNS) mit Desoxyribose als glycosidischen Bestandteil unterscheiden sich im Verhalten schon durch erhebliche größere Empfindlichkeit des erstgenannten gegenüber Einflüssen der Umgebung". 
"RNA ist im Vergleich zu DNA sehr auffällig für spontane und enzymatisch katalysierte Hydrolyse"  
"RNA Moleküle sind stärker hydratisiert als DNA-Moleküle." 
Die Acridinorange Methode von L.von Bertalanffy und N.Schümmelfeder basiert auf der festen Überzeugung, daß die färberische Differenz von Ribo -und Desoxyribonucleinsäure durch Unterschiede im Polymerisationsgrad der beiden Nucleinsäuren liegt. Zur Prüfung dieser Meinung wurden die Zellausstriche und Gewebeschnitten mit a) Ribonicleinsäure, b) kochendem Wasser bearbeitet.
Was weißt man über die Wirkung der Ribonuclease?
" Interessant ist die Tatsache, daß die Ribonuclease gegen lebende Zellen unwirksam ist. " 
"Das Enzym beseitigt einzelsträngige RNA." 
"Ribonuclease atakiert in erster Linie Einzelstränge der t-RNK und berührt nicht die Doppelstränge." 
Die Aussagen kann man so interpretieren: L.von Bertalanffy und N.Schümmelfeder färbten nach der Fixation mit Alkohol und Carnoyscher-Lösung die Enzelsträngge RNA. Dann ist es auch kein Wunder, daß das Zytoplasma nach Acridinorange- Färbung rot fluoreszierte.
Der zweite Versuch mit kochendem Wasser wurde ich nicht als Depolymerisation, sonder als Denaturation erklären. Kochendes Wasser kann nur Wasserstoffbrücken, nicht kovalente Bindungen zerstören. "Im Jahre 1960 berichteten Mormur, Doty und Kollegen, daß erhitzen von DNA-Molekülen in Lösung zu einer Dissoziation der beiden Strängen  (Denaturierung) führt."   Mit diesem Experiment haben N.Schümmelfeder, K.J.Ebschner. E.Krogh die DNS nicht depolymerisiert, sonder denaturiert und aus grün fluoreszierender (dd)-doppelsträngiger DNS ist rot fluoreszierende (ss) einzelsträngige DNS entstanden. Die Meinung:"Die Eigenart des AO hochpolymere DNS in gelben und niedrigpolymere Nucleinsäure in roten Fluoreszenzfarben darstellen kann zur Differenzialfärbung von Zellkernen und cytoplasmanucleoproteiden benutzt werden."  ist leider falsch.
 Acridinorange unterscheidet nicht zwischen hochpolymeren und niedrigpolymeren, nicht zwischen DNS und RNS, der Farbstoff unterscheidet zwischen (dd)-Strängen (grüne Fluoreszenz) und (ss)-Strängen (rote Fluoreszenz).  ;
 
 Zusammenfassung.
 Die Idee von L. von Bertalanffy : " Zytoplasmatische Charaktere in die Krebsforschung in Betrach ziehen" war richtig, aber die Methode war falsch. Die Acridinorange-Methode zeigt sehr frühe biochemische Veränderungen im Cytoplasma in vitalen und sypravitalen Präparaten an. Nach Fixation mit Alkohol, oder Carnoyscher-Lösung funktioniert es leider nicht.Die Fixativen verändern in erster Stelle RNA, die sehr empfindlich ist. Die rote fluoreszenz des Zytoplasmas bedeutet nicht, daß die Zelle mehr RNA produziert, das bedeutet, daß die RNA in einer anderer Konformation vorliegt. In proliferierenden Organismen liegt die RNA überwigend in "random-coil Konformation."