Benutzer:Solfiz/Voltage-Clamp

Unter Voltage-Clamp versteht man ein Verfahren, mit dem man Strom-Spannungs-Zeit-Beziehungen einer Biomembran mithilfe einer Rückkopplungsschaltung erfassen kann. Dabei wird der Verlauf des elektrischen Stroms gemessen, der zur Einhaltung eines vorgegebenen Spannungsprotokolls nötig ist (s. Potentiostat).

Das Problem

besteht im elektrischen Zugang zur Innenseite einer Zelle, der typischerweise durch Glasmikropipetten hergestellt wird, welche die Membran möglichst wenig verletzen sollen und dadurch einen elektrischen Widerstand R_el haben, der viel größer ist als der Membranwiderstand R_m (s. Hodgkin-Huxley-Modell, Elektrische Erregung). Wollte man also an die Membran über die Mikropipetten eine gewünschte Testspannung U_t mit einer äußeren Spannungsquelle anlanlegen, käme an der Membran nur der Bruchteil U_m' = U_t·R_m/(R_m + R_el) << U_t an.

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Abb. 1: Voltage-Clamp-Messanordnung für Membranstrom-Spannungs-Zeit-Beziehungen einer großen, langgestreckten Zelle, z.B. Riesenaxon eines Tintenfischs

Die Lösung

des Problems), erzielt man durch die Voltage-Clamp-Schaltung, die in Abb. 1 für große, langgestreckte Zellen Z, (z.B. das Riesenaxon des Tintenfischs) skizziert ist. Gibt man als Testspannung U_t ein Clamp-Protokoll mit zeitlich variierter Spannung ein, lässt sich aus dem Verlauf des Clampstroms, I, bei bekannter Geometrie die (membranflächenbezogene) Strom-Spannungs-Zeit-Beziehung der Membran erfassen.

Zur Terminologie

Wenn man wie in Abb. 1 bei homogener Stromdichte über einen definierten Zellabschnitt misst, spricht man von Space-Clamp, wenn das nicht gelingt, von Point-Clamp (die Spannung wird nur am Ort der Spannungselektrode auf dem Sollwert gehalten). Bei Patch-Clamp werden mit einer ganz anderen Technik nur die elektrischen Eigenschaften eines winzigen Areals vom Öffnungsdurchmesser der Glasmikropipette ( ≈ 1 µm) untersucht. Buchstäbliche Übersetzungen von Voltage-Clamp als Spannungsklemme sind irreführend, weil nirgends sonst Regelung durch Rückkopplung als Klemme bezeichnet wird. Potentiostasie wäre korrekt, hat sich aber (im Gegensatz zur Elektrochemie, (s. Potentiostat) in der Elektrophysiologie nicht eingebürgert.

Versuchsaufbau

Abb 1. zeigt schematisch einen Versuchsaufbau zur Messung von Strom-Spannungs-Zeit-Beziehungen einer Biomembran durch Voltage-Clamp. Das ist ein Rückkopplungs-Schaltkreis zur Einhaltung einer - auch zeitlich veränderlichen - wählbaren (Trans-)Membranspannung (Membranpotential) U_m. Dazu wird die mit dem Operationsverstärker OP_U in Spannungsfolger-Schaltung gemessene Membranspannung U_m (Istwert) mit einer frei einstellbaren Testspannung, U_t (Sollwert, Führungsgröße) verglichen. Die Differenz, U_m - U_t, wird dann mithilfe des Stromverstärkers, Operationsverstärker OP_I, hoch verstärkt, so dass seine Ausgangsspannung so viel Strom über die koaxiale Stromelektrode (schwarz) in die Zelle Z einspeißt, dass U_m = U_t. Durch geeignete Elektrodengeometrie (im Bild unten) wird erreicht, dass über einen längeren Zellabschnitt überall dieselbe Dichte (parallele und äquidistante Pfeilchen) des Membranstroms herrscht. Misst man den durch die Membran zur Erde fließenden Strom, I, über einen Zylinderabschnitt definierter Länge, erhält man die gewünschte Membranstromdichte (Im^-2) bei der durch U_t eingestellten Membranspannung U_m. Beschriftungssymbole: U_t = Testspannung, Führungsgröße, kann frei (auch zeitvariabel) vom Experimentator eingestellt werden; U_m = (Trans-)Membranspannung , abgeleitet vom Zellinneren durch elektrolyt-(KCl-)gefüllte Glasmikropipette (µPip) an (nicht-invertierenden) Eingang des Spannungsverstärkers OP_U (Spannungsfolger: eigentlich wird nicht die Spannung verstärkt - die ist bei dieser Schaltung nämlich am Ausgang, U_A gleich wie am Eingang U_m - sondern die Leistung, dadurch dass der Ausgangswiderstand R_A(z.B. 100 Ω) von OP_U viel geringer ist als sein Eingangswiderstand R_E,(z.B. 10¹² Ω), welcher wiederum viel größer sein muss als der Elektrodenwiderstand R_el (z.B. 10⁶ Ω); eingezeichnete Widerstände: R₁ = R₂ (z.B. 10³ Ω) sorgen für gleiche Wichtung (Mitte des Spannungsteilers) von U_t und U_A (= U_m) für die Spannung im Summationspunkt Σ am (invertierenden) Eingang des Stromverstärkers OP_I. Mit dem Rückkopplungswiderstand R_V am Stromverstärker, OP_I, kann man die Verstärkereigenschaften der Realität gegenüber optimieren. Im Idealfall fällt er weg (R_V = ∞, Verstärkungsfaktor = ∞).

Elektrische Charakteristik einer hypothetischen Membran.

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Abb. 2: Strom-Spannungs-Beziehung I_ap_a als Produkt einer (hier linearen, gestrichelt) Transportfunktion I_a und einer Gatingfunktin p_a

Gegeben sei eine Biomembran mit einem elektrisch leitenden Membranprotein, das in einem aktiven (offenen, leitenden) Zustand a mit der mittleren Wahrscheinlichkeit p_a (0 < p_a < 1) oder in einem inaktiven (geschlossenen, nicht-leitenden) Zustand i mit der mittleren Wahrscheinlichkeit p_i = 1 - p_a vorliegen kann. Die hier zur besseren Verständlichkeit getroffenen Vereinfachungen gegenüber der Realität bestehen darin dass, a) in einer Biomembran verschiedene leitende Membranproteine vorkommen, b) für ein einziges Protein mehrere Zustände der Aktivität (Offenzustände) und vor allem der Inaktivität (Geschlossenzustände) existieren können, c) die Leitfähigkeit des aktiven Proteins linear ist (Abb. 2, gestrichelte Linie), und d) die elektrische Membrankapazität (s. Erregungsleitung) zunächst außer Betracht gelassen wird. Auf sie wird am Ende dieses Artikels noch eingegangen.

Abb. 2 zeigt das Schema einer stationären, einwärtsgleichrichtenden Strom-Spannungs-Beziehung I_ap_a als Resultat einer linearen Strom-Spannungsbeziehung (gestrichelt) eines voll aktiven Enzyms, das den Transport von Ionen über eine Lipidmembran katalysiert, sowie die spannungsempfindliche Aktivitätswahrscheinlichkeit p_a(u) dieses Enzyms, die im Negativen hoch ist und im Positiven Null wird. Die nicht-skalierte Spannungsachse u kann so verstanden werden, dass der Schnittpunkt mit der eingezeichneten Stromachse die aktuelle Umkehrspannung (die Spannung, bei der der Strom sein Vorzeichen wechselt) markiert. Wie häufig der Zustand a und wie häufig der Zustand i vorliegt, ist durch die Geschwindigkeitskonstanten (Übergangswahrscheinlichkeiten) k_ia und k_ai bestimmt: p_a = k_ia/(k_ia + k_ai) = 1/(1 + k_ai/k_ia) und p_ii = 1 - p_a = 1/(1 + k_ai/k_ia) (s. Abb. 3).

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Abb. 3: Reaktionsschema für Spannungsempfindlichkeit der Aktivität, p_a(u), eines Enzyms.

Typischerweise hängt die Aktivität p_a solch eines Proteins von der elektrischen Spannung U über die Membran ab (englisch Voltage gating), was mit entsprechenden Spannungsabhängigkeiten von k_ai und k_ia beschrieben werden kann (Abb. 3). Dazu kann man sich vorstellen, der Schalter zwischen a und i trüge eine elektrische Ladung, sagen wir eine positive. Dann wird durch Anlegen einer positiven Spannung das Gleichgewicht in Richtung i verschoben durch Zunahme von k_ai und/oder Abnahme von k_ia. Wie stark, kann durch die beiden Spannungsempfindlichkeitskoeffizienten d_ia = z_gδ und d_ai = z_g(δ − 1) in den Expontentialausdrücken exp(d_iau) und exp(d_iau) * ausgedrückt werden, wobei die Ladungszahl z_g (apparente gating charge) die generelle Spannungsempfindlichkeit angibt, und δ (0 < δ < 1) den relativen Anteil, mit dem die Hin- und Rückreaktion von der Spannung betroffen sind. Mit unseren vereinfachenden Annahmen z_g = 1 und δ = 1/2 (Symmetrie) erhalten wir die gegebenen Ausdrücke e^u/2 und e^-u/2 in Abb. 3 für die Spannungsempfindlichkeiten. Die resultierende Funktion p_a(u) ist in Abb. 4 skizziert.

*zur einfacheren Schreibweise benutzen wir gern die reduzierte, dimensionslose Spannung u = UF/(RT) mit der normalen Spannung U (in Volt) und den üblichen, thermodynamischen Symbolen F (Faradaykonstante), R (universelle Gaskonstante) und T (Absolute Temperatur).

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Abb. 4: Gating-Funktion p_a(u) eines spannungsempfindlichen Enzyms (s. Abb. 3)

Abb. 4. zeigt eine typische Gating-Funktion p_a(u) für ein spannungsempfindliches Enzym (s. Abb. 3) mit voller Aktivitätswahrscheinlichkeit p_a = 1 bei negativen Spannungen, die für zunehmend positive Spannungen gegen Null geht. Sie reicht von voller Aktivität bei sehr negativen Spannungen bis zu völliger Inaktivität im Positiven, wobei der charakteristische Wert p_a = 1/2 bei derjenigen Spannung eintritt, wenn k_ai = k_ia.

Die stationäre, einwärtsgleichrichtende Strom-Spannungs-Beziehung I(u) = I_a(u)p_a(u) in Abb. 2 (durchgezogene Kurve) ist also das Produkt aus der (hier linearen) Strom-Spannungs-Beziehung der Transport-Funktion, I_a(u), des voll aktiven Enzyms dieser Membran und der (hier sigmoiden) Aktivitäts-Spannungs-Beziehung (Abb. 4), p_a(u), der Gating-Funktion.

Das zeitliche Verhalten dieser Konfiguration ist ebenfalls durch k_ai und k_ia gegeben. Befindet sich das System in Abb. 3 bei einer bestimmten Spannung u nicht im Gleichgewicht p_ak_ai = p_ik_ia, wird es sich diesem Gleichgewicht exponentiell (e^-t/τ) mit der Zeitkonstanten τ = 1/(k_ai + k_ia) nähern, beziehungsweise mit e^-λt und der Geschwindigkeitskonstanten λ = 1/τ.

Die entsprechenden Spannungsabhängigkeiten von k_ai und k_ia (s. Abb. 3) sowie von λ sind in Abb. 5 illustriert, welche durch die logarithmische Ordinate mit linearen ln(k)-u-Beziehungen als Asymptoten für λ(u) übersichtlich wird. Die Achsenabschnitte der beiden Asymptoten bei u = 0 liefern die fundamentalen Geschwindigkeitskonstanten k_ai⁰ und k_ia⁰. Bemerkenswert ist, dass das Minimum der Funktion λ(u) bei derselben Spannung liegt wie p_a(u) = 1/2 (Abb. 4), nämlich wenn k_ai = k_ia.

Clamp-Protokoll zur Bestimmung von I_a(u), k_ai⁰, d_ai, k_ia⁰ und d_ia

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Abb. 5: Schema zur Bestimmung der Systemparameter für die zeitliche Charakteristik eines Reaktionssystems wie in Abb. 3

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Abb. 6. Schematischer Verlauf eines typischen Voltag-Clamp-Experiments zur Identifizierung der Parameter für die Strom-Spannungs-Zeit-Beziehung eines ladungstransportierenden Enzyms mit spannungsempfindlicher Aktivität.

Aus strategischen Gründen wird u₁ nach Möglichkeit so gewählt, dass p_a ≈ 1. Werden jetzt Spannungssprünge nach u₂ ausgeführt, liefert der anfängliche Strom (nach Einhaltung einiger Vorsichtsmaßnamen bezüglich der Apparatur und der hier vernachlässigten Membrankapazität) die isolierte Transportfunktion I_a(u) des voll-aktiven Enzyms, nämlich bevor p_a < 1 wird. Aus dem exponentiellen Abfall des Stroms ermitteln wir für jedes u₂ ein λ und tragen es in eine Diagramm wie Fig. 5 ein. Bei p_a = 0.5 sollte λ ein Minimum aufweisen, bei u = 0 kann man durch Extrapolation der Asymptoten die Werte von k_ai⁰ und k_ia⁰ ablesen, und deren Spannungsempfindlichkeitskoeffizienten d_ai und d_ia ergeben sich aus den Steigungen der Asymptoten in diesem Diagramm. Damit sind alle Parameter ermittelt, welche die Strom-Spannungs-Zeit-Beziehung des zu untersuchenden Systems bestimmen. Die Stromantwort auf die Zurückstufung von den verschiedenen u₂-Niveaus auf immer dasselbe u₁ ist weniger interessant, kann aber als nützliche Stabilitätskontrolle für das System dienen.

Membrankapazität und zeitliche Auflösung

Alternativ zu Voltage-Clamp (Messung des Stroms bei vorgegebener Spannung) kann man auch den Verlauf der Spannungsänderung auf Stromstufen mit geringerem apparativem Aufwand verfolgen. Das wird Current-Clamp genannt, auch wenn der eingespeiste Strom nicht durch eine Rückkopplungsschaltung geregelt wird, sondern nur durch einen Funktionsgenerator über einen großen Vorwiderstand >> R_el und eine weitere Mikropipette in die Zelle geleitet wird. Die zeitliche Auflösung der Current-Clamp-Anordnung wird durch die Zeitkonstante der Biomembran τ_m = R_mC_m limitiert ( ≈ 1 ms bei R_m ≈ 0.1 Ωm² und einer Membrankapazität C_m im Bereich von 10 mF m^-2).

Bei der Voltage-Clamp-Anordnung dagegen ist die zeitliche Auflösung durch die Dauer t des maximalen Stroms U_G/R_I (U_G: maximale Ausgangsspannung (Generatorspannung) des Stromverstärkers OP_I, R_I: Widerstand der stromzuführendenden Elektrode) gegeben, der nötig ist, um die Membrankapazität C_m von U₁ auf U₂ umzuladen. Physikalisch: t = (U₂ - U₁)C_mR_I/U_G. Dabei kann der Experimentator die zeitliche Auflösung der Apparatur in Abb. 1 durch niederohmige Stromelektroden und und hohe Generatorspannung deutlich unter eine Millisekunde bringen, was für den Erfolg der elektrophysiologischen Untersuchung am Aktionspotential von tierischen Neuronen entscheidend war und ist.

Noch ein Vorteil von Voltage- gegenüber Current-Clamp

Gibt es in der Strom-Spannungs-Beziehung einer Biomembran einen Bereich mit negativer Steigung (durchgezogene Linie rechts in Abb. 2), wie es für erregbare Membranen typisch ist, kann man durch Current-Clamp-Experimente, u(I), diesen Bereich nicht eindeutig erfassen, weil zu jedem I-Wert zwei (oder drei bei N-förmigen I(u)-Kurven) u-Werte der gesamten I(u)-Kurve gehören. Dagegen gehört im Voltage-Clamp-Experiment zu jedem u-Wert immer nur ein I-Wert und erlaubt somit die Erfassung der gesamten I(u)-Kurve.