Optische Transfektion

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Unter optischer Transfektion versteht man das Einbringen von Nukleinsäuren in Zellen (Transfektion) mit Hilfe von Licht. Typischerweise wird ein Laser mit einem Mikroskopobjektiv mit hoher numerischer Apertur auf einen beugungsbegrenzten Spot mit ungefähr 1 µm Durchmesser fokussiert. Die Plasmamembran einer Zelle wird dann für eine kurze Zeit (typischerweise einige Millisekunden bis Sekunden) diesem stark fokussierten Licht ausgesetzt, wodurch eine transiente Pore auf der Membran erzeugt wird. Durch die Erzeugung einer Photopore können exogene Plasmid-DNA, RNA, organische Fluorophore oder größere Objekte wie Halbleiter-Quantenpunkte in die Zelle gelangen. Bei dieser Technik wird jeweils nur eine Zelle behandelt, was sie besonders für die Einzelzellanalyse geeignet macht.

Vereinfacht gesagt, lassen Zellen normalerweise bestimmte Arten von Substanzen nicht in ihr Inneres. Mit Hilfe von Lasern kann ein winziges Loch in die Zelloberfläche gebrannt werden, durch das diese Substanzen eindringen können. Dies ist für Biologen, die Krankheiten untersuchen, von großem Nutzen, da eine häufige experimentelle Anforderung darin besteht, Stoffe (wie z. B. DNA) in Zellen einzubringen.[1]

Diese Technik wurde erstmals 1984 von Tsukakoshi et al. demonstriert, die eine frequenzverdreifachte Nd:YAG-Laser verwendeten, um eine stabile und transiente Transfektion von normalen Rattennierenzellen zu erzeugen. Seitdem wurde die optische Transfektion an einer Vielzahl von Säugetierzelltypen unter Verwendung verschiedener Laserquellen demonstriert, darunter 405 nm Dauerstrich (cw),[2] 488 nm cw,[3] oder mithilfe von Modenkopplung wie bei dem 800 nm Ti:Saphir[4][5][6][7][8][9][10][11][12][13] oder der 1064 nm nanosekunden-gepulste Nd:YAG.[14][15]

Durchführung

Eine typische optische Transfektion wird nach diesem Prinzip durchgeführt:[11] Zuerst wird eine optische Pinzette mit einem Objektiv mit hoher NA aufgebaut. Hiernach werden die Zellen bis zu einer Konfluenz von 50–60 % kultiviert. Danach werden diese in eine Lösung mit mindestens 10 µg/ml Plasmid-DNA gegeben. Die Plasmamembran jeder Zelle mit wird 10–40 ms mit fokussiertem Laser bei einer Leistung von weniger 100 mW bestrahlt. Zum Schluss werden die Kolonien 24–96 beobachtet. Falls die Bildung stabiler Kolonien gewünscht ist, wird noch ein Nährmedium hinzugegeben.

Einzelnachweise

  1. ↑ M. Tsukakoshi, S. Kurata, Y. Nomiya, Y. Ikawa, T. Kasuya: A novel method of DNA transfection by laser microbeam cell surgery. 1984, doi:10.1007/BF00697702 (englisch, semanticscholar.org [abgerufen am 5. März 2021]).
  2. ↑ L. Paterson, B. Agate, M. Comrie, R. Ferguson, T. Lake: Photoporation and cell transfection using a violet diode laser. In: Optics Express. Band 13, Nr. 2, 24. Januar 2005, ISSN 1094-4087, S. 595–600, doi:10.1364/opex.13.000595, PMID 19488389 (englisch).
  3. ↑ G. Palumbo, M. Caruso, E. Crescenzi, M. F. Tecce, G. Roberti: Targeted gene transfer in eucaryotic cells by dye-assisted laser optoporation. In: Journal of Photochemistry and Photobiology. B, Biology. Band 36, Nr. 1, Oktober 1996, ISSN 1011-1344, S. 41–46, doi:10.1016/S1011-1344(96)07335-6, PMID 8988610 (englisch).
  4. ↑ X. Tsampoula, K. Taguchi, T. Cizmár, V. Garces-Chavez, N. Ma: Fibre based cellular transfection. In: Optics Express. Band 16, Nr. 21, 13. Oktober 2008, ISSN 1094-4087, S. 17007–17013, doi:10.1364/oe.16.017007, PMID 18852810 (englisch).
  5. ↑ Aisada Uchugonova, Karsten König, Rainer Bueckle, Andreas Isemann, Gabriel Tempea: Targeted transfection of stem cells with sub-20 femtosecond laser pulses. In: Optics Express. Band 16, Nr. 13, 23. Juni 2008, ISSN 1094-4087, S. 9357–9364, doi:10.1364/oe.16.009357, PMID 18575499 (englisch).
  6. ↑ Christian T. A. Brown, David J. Stevenson, Xanthi Tsampoula, Craig McDougall, Alexander A. Lagatsky: Enhanced operation of femtosecond lasers and applications in cell transfection. In: Journal of Biophotonics. Band 1, Nr. 3, August 2008, ISSN 1864-0648, S. 183–199, doi:10.1002/jbio.200810011, PMID 19412968 (englisch).
  7. ↑ J. Baumgart, W. Bintig, A. Ngezahayo, S. Willenbrock, H. Murua Escobar: Quantified femtosecond laser based opto-perforation of living GFSHR-17 and MTH53 a cells. In: Optics Express. Band 16, Nr. 5, 3. März 2008, ISSN 1094-4087, S. 3021–3031, doi:10.1364/oe.16.003021, PMID 18542388 (englisch).
  8. ↑ Ming Lei, Hanpeng Xu, H. Yang, B. Yao: Femtosecond laser-assisted microinjection into living neurons. In: Journal of Neuroscience Methods. 2008, doi:10.1016/j.jneumeth.2008.07.006 (englisch, semanticscholar.org [abgerufen am 5. März 2021]).
  9. ↑ American Institute of Physics: Applied physics letters online. American Institute of Physics, Woodbury, N.Y. 1994 (englisch, ebscohost.com [abgerufen am 5. März 2021]).
  10. ↑ Cheng Peng, Robert E. Palazzo, Ingrid Wilke: Laser intensity dependence of femtosecond near-infrared optoinjection. In: Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. Band 75, 4 Pt 1, April 2007, ISSN 1539-3755, S. 041903, doi:10.1103/PhysRevE.75.041903, PMID 17500917 (englisch).
  11. ↑ a b D. Stevenson, B. Agate, X. Tsampoula, P. Fischer, C. T. A. Brown: Femtosecond optical transfection of cells: viability and efficiency. In: Optics Express. Band 14, Nr. 16, 7. August 2006, ISSN 1094-4087, S. 7125–7133, doi:10.1364/oe.14.007125, PMID 19529083 (englisch).
  12. ↑ Lindy E. Barrett, Jai-Yoon Sul, Hajime Takano, Elisabeth J. Van Bockstaele, Philip G. Haydon: Region-directed phototransfection reveals the functional significance of a dendritically synthesized transcription factor. In: Nature Methods. Band 3, Nr. 6, Juni 2006, ISSN 1548-7091, S. 455–460, doi:10.1038/nmeth885, PMID 16721379.
  13. ↑ Uday K. Tirlapur, Karsten König: Targeted transfection by femtosecond laser. In: Nature. Band 418, Nr. 6895, 18. Juli 2002, ISSN 0028-0836, S. 290–291, doi:10.1038/418290a, PMID 12124612 (englisch).
  14. ↑ J. S. Soughayer, T. Krasieva, S. C. Jacobson, J. M. Ramsey, B. J. Tromberg: Characterization of cellular optoporation with distance. In: Analytical Chemistry. Band 72, Nr. 6, 15. März 2000, ISSN 0003-2700, S. 1342–1347, doi:10.1021/ac990982u, PMID 10740880 (englisch).
  15. ↑ S. Mohanty, M. Sharma, P. Gupta: Laser-assisted microinjection into targeted animal cells. In: Biotechnology Letters. 2004, doi:10.1023/A:1024038609045 (englisch, semanticscholar.org [abgerufen am 5. März 2021]).
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