Taq-Polymerase
| Taq-Polymerase I | ||
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Vorhandene Strukturdaten: s. UniProt | ||
| Masse/Länge Primärstruktur | 835 Aminosäuren | |
| Bezeichner | ||
| Gen-Name(n) | polA | |
| Externe IDs | ||
| Enzymklassifikation | ||
| EC, Kategorie | 2.7.7.7, Nukleotidyltransferase | |
| Substrat | Desoxyribonucleosidtriphosphat + DNAn | |
| Produkte | Diphosphat + DNAn+1 | |
Die Taq-Polymerase ist die thermostabile DNA-Polymerase des Bakteriums Thermus aquaticus (Taq). Dieses Bakterium lebt in Geysiren bei etwa 70 °C. Taq-Polymerase ist außerordentlich hitzebeständig und gehört zu den Extremozymen. 1969 wurde die Taq-Polymerase erstmals von Thomas D. Brock und Hudson Freeze isoliert.
Eigenschaften
Das Enzym wird hauptsächlich zur DNA-Vervielfältigung mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt. DNA-Polymerasen von mesophilen Organismen würden bei Erhitzung während der Polymerase-Kettenreaktion denaturiert und müssten nach jedem Zyklus neu hinzugegeben werden. Bei der DNA-Vervielfältigung mit Taq-Polymerase ist dies nicht notwendig, da das Enzym auch bei hohen Temperaturen noch sehr stabil ist (die Enzym-Halbwertszeit beträgt bei 97,5 °C ca. 9 Minuten[1]). Die DNA-Amplifikation mit Taq ist jedoch fehleranfällig, denn das Enzym besitzt keine 3' → 5'-Exonukleaseaktivität und damit keine proof reading-Funktion. Die Fehlerrate der Taq-Polymerase beträgt 8 · 10−6 Fehler pro Basenpaar.[2] In den amplifizierten DNA-Fragmenten finden sich deshalb häufig Mutationen, die durch ungenaues Kopieren des Matrizenstranges entstehen. Werden sequenzexakte DNA-Amplifikate benötigt, empfiehlt sich daher der Einsatz von Polymerasen mit proof reading-Funktion, etwa von Pfu-, Pwo-Polymerase oder Pfx-Polymerasen (die ursprünglich ebenfalls aus thermophilen Mikroorganismen isoliert wurden), deren Einsatz jedoch kostenintensiver ist.
Bei der Amplifikation eines DNA-Fragments hängt die Taq-Polymerase ein zusätzliches Nukleotid (dATP) an das 3'-Ende des synthetisierten Strangs. Man spricht von einem 3'-A-Überhang (A für Adenin), da sich auf dem Matrizenstrang keine komplementäre Nukleobase (Thymin) befindet. Der 3'-Überhang wird durch das Fehlen der proof reading-Funktion nicht korrigiert und findet Anwendung beim Verfahren der TA-Klonierung. Durch eine Deletion der ersten 289 Aminosäuren wird das Stoffel-Fragment erzeugt.[3]
Die Massenproduktion des Enzyms erfolgt durch Übertragung des Gens auf einen Stamm des Bakteriums Escherichia coli. Aus diesen Kulturen wird das Protein gereinigt und in einem glycerolhaltigen Puffer bei −20 °C aufbewahrt.
Einzelnachweise
- ↑ F. C. Lawyer, S. Stoffel, R. K. Saiki u. a.: High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity. In: PCR Methods Appl. Band 2, Nr. 4, Mai 1993, S. 275–287, PMID 8324500.
- ↑ J. Cline, J. C. Braman, H. H. Hogrefe: PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. In: Nucleic Acids Research. (1996), Bd. 24(18), S. 3546–51. PMID 8836181; PMC 146123 (freier Volltext).
- ↑ S. Dabrowski, J. Kur: Recombinant His-tagged DNA polymerase. II. Cloning and purification of Thermus aquaticus recombinant DNA polymerase (Stoffel fragment). In: Acta biochimica Polonica. Band 45, Nummer 3, 1998, S. 661–667, PMID 9918492.
