Benutzer:Entinator/Expressionsklonierung

Prinzip

In den meisten Fällen werden cDNAs untersucht und auf der Basis der Eigenschaften des von ihnen codierten Proteins isoliert. Zu diesem Zweck werden cDNAs von der mRNA des Organismus, des Gewebes, des Zelltyps, oder des Entwicklungsstadiums generiert und in die Klonierungsstelle eines Expressionsvektors ligiert. [...] Die RNAs werden nach Injektion (ausschließlich!) in Eizellen des Krallenfrosches Xenopus laevis translatiert. Die Eizellen werden darauf untersucht, ob das gesuchte Protein vorhanden ist. Die positiven Pools werden in Subpools aufgetrennt, bis genau eine RNA den gewünschten Effekt hervorruft.

Beispiele, wofür dieses Prinzip angewendet wird

• So wurde z. B. die erste cDNA eines spannungsgesteuerten Kaliumkanals aus dem elektrischen Organ des Marmor-Zitterrochens isoliert.
• um z. B. einem Ionenkanal oder einem G-Protein-gekoppelten Rezeptors zu finden
• Ein Beispiel für diese Strategie ist die Klonierung des ATP-Rezeptors.

Beispiele für bestimmte Verfahren

Nachweis der gesuchten Proteine

• Viele der heute bekannten cDNAs wurden mittels des Bakteriophagen Lambda gt11-Expressionssystems charakterisiert. Der Bakteriophage Lambda erlaubt eine sehr dichte Ausplattierung??? auf einem E. coli-Bakterienrasen. Jede Plaque entspricht einem Klon, der nach Induktion ein β-Galactosidase-Fusionsprotein generiert. Der Nachweis der Proteine(der Fusionsproteine?) gelingt nach Übertragung des Phagen auf einen Membranfilter (häufig Nitrocellulose). Das geschieht:
  • z. B. mittels eines Antikörpers gegen das zu untersuchende Protein
  • im Falle von Transkriptionsfaktoren (heißt das, die Transkriptionsfaktoren werden gesucht?) mit einer radioaktiv markierten doppelsträngigen DNA.

auch Nachweis der gesuchten Proteine?

• Eine weitere Methode setzt sogenannte Pools von cDNA-Klonen in Vektoren ein, die eine in vitro-Transkription mit RNA-Polymerasen aus Bakteriophagen, wie der T7-RNA-Polymerase, erlauben.
• Auch das Hefe-Zwei-Hybrid-System, das Hefe-Ein-Hybrid-System und das Phagen-Display werden zur Expressionsklonierung genutzt.